به علت سفت بودن بافت و عدم توانایی در جذب مواد مورد استفاده در مرغ برگرها از مرغ مادر استفاده نمی شود ولی در محصولاتی که مواد تردکننده استفاده میشود میتواند به کار رود، البته از نظر استاندارد استفاده از مرغ مادر به علت آلودگی ممنوع است (Farkas and Singh 1991; Hongsheng, Qingshu et al. 1997).
در تولید خمیر مرغ تقلباتی صورت میگیرد از قبیل:
1) در بعضی از کارخانجات مرغ منجمد را بهطور کامل در دستگاه بادر میاندازند چون همه به صورت خمیر درمیآیند مشخص نمیشود، این خمیر آلودگی بسیار بالایی دارد چون پوست، بال و رگههای گردن را نمی گیرند.
2) اندازه فیلترها را بزرگتر میکنند یا دو بار از بادر رد میکنند که باعث میشود در محصول ریز استخوانهایی باقی بماند که وقتی خورده میشود در دهان احساس میشود. اگر تولید خمیر مرغ از اسکلت به صورت اصولی تهیه شود از نظر تغذیهای مفید هم میباشد.
1-3-انواع تقلب در فرآورده های غذایی
با افزایش روز افزون جمعیت، تهیه غذای کافی یکی از مسایل پیچیده ومهم جهان امروز به شمارمی رود. هر ساله میلیون ها مورد بیماری در جهان بر اثر استفاده مواد غذایی ناسالم دیده می شود. مواد غذایی همواره دارای مشتری و کاربرد عمومی هستند. گاهی ممکن است افراد سودجو و متقلب به فکر استفاده از بازار پر فروش و پر رونق آن بیفتند و برای کم کردن هزینه های تولید و به دست آوردن سود بیشتر دست به تقلب در موادغذایی بزنند که از این راه سلامت مردم را به خطر می اندازند. بیشتر این تقلب ها در بازار خرده فروشی هاست؛ اما گاه ممکن است به بازار فروش مواد اولیه هم سرایت کند. بنابراین آشنایی با این تقلب ها و راه های تشخیص آن برای کنترل مواد غذایی بسیار مفید است (Regattieri, Gamberi et al. 2007; Spink and Moyer 2011).
1-3-1-تقلب در فرآورده های گوشتی
تقلب در گوشت قرمز: گوشت و بیشتر فرآورده های آن گران قیمت هستند و امکان تقلب در آن ها زیاد است.
از جمله تقلب هایی که در فرآورده های گوشتی اتفاق می افتد عبارتند از:
• افزودن مواد ازته غیرپروتئینی به نحوی که در آزمون های کنترل مقدار ازت بالا تر به نظر برسد
• افزودن پودر استخوان به فرآورده های گوشتی مانند سوسیس و کالباس
• افزودن پودر خون به همبرگر و سوسیس و کالباس
• رعایت نکردن فرمول و استاندارد فرآورده های گوشتی و افزودن مقادیر زیاد مواد پر کننده
• افزودن نیتریت و نیترات به مقدار بیش از حد برای بهبودی رنگ و جلوگیری از رشد میکروارگانیسم ها در موارد آلودگی شدید
فر آورده های گوشتی یکی از پر مصرف ترین فرآورده های غذایی به شمار آمده و تنها درکشور آلمان که یکی از بزرگترین تولید کننده های فرآورده های گوشتی می باشد بیش از پانصد نوع محصول گوشتی با اسامی مختلف وجود دارد. در سایر نقاط جهان نیز تعداد این محصولات بسیار فراوان می باشد و به 1200 نوع می رسد. با توجه به این که مصرف فرآورده های گوشتی به دلایل مقرون به صرفه بودن این فرآورده ها نسبت به قیمت خرید گوشت سفید یا قرمز، تسهیل در پخت و پز و مطلوب بودن طعم آن نسبت به غذای سنتی، روند رو به رشدی در جامعه پیداکرده است، برخی از تولیدکنندگان این فرآورده ها مبادرت به تولید محصولاتی نموده اند که در تولید آن بافت های نامطلوب و غیر مجاز نیز به کار برده اند. حضور این بافت های غیر مجاز در فرآورده های گوشتی یک مشکل حقیقی در شناسایی آن از بافت های مجاز آن فرآورده ایجاد می کند. با این وضعیت به کار گیری روشی دقیق برای شناسایی بافت های غیر مجاز در فرآورده های گوشتی حرارت دیده غیر قابل اجتناب می باشد تا سطح کیفیت این نوع فرآورده ها را بیشتر مورد توجه قرار دهد (Anklam and Battaglia 2001). هنگامی که روشی برای شناسایی بافت های غیر مجاز وجود داشته باشد می توان مجازاتی را نیز برای افراد خاطی که از بافت های غیر مجاز در تولید فرآورده های گوشتی حرارت دیده استفاده می کنند تعیین نمود.
1-4-کنترل کیفیت فرآورده های گوشتی
کنترل کیفیت مواد غذایی فرآیندی است که میزان تبعیت یک ماده غذایی بسته بندی شده از برچسب نگاشته شده بر روی خود را بررسی می نماید. آرتور هیل برای اولین روشی را جهت بررسی و کنترل کیفیت مواد غذایی در سال 1861 ارائه کرد که به صورت بررسی میکروسکوپی دارویی انجام شد (Hassall 1876).
تعریف جهانی که از واژه کنترل کیفی و یا اعتبار سنجی وجود دارد طبق قانون 2002/178 کمیسیون اروپا است، درواقع یک واژه تعریف شده است که توانایی شناسایی گونه های مختلف و فرآورده های حیوانی را طی مراحل مختلف در زنجیره غذایی (مراحل تولید تا توزیع) نمایان می کند. از طرفی دیگر مطابق قوانین کمیسیون اروپا به منظور ایمنی مواد غذایی، در تمام دنیا تولیدکنندگان ملزم به آشکارسازی و بیان نام تمام مواد اولیه خام مورد استفاده بر روی برچسب فرآورده های غذایی هستند.
امروزه اعتماد به برچسب های قرار گرفته شده بر روی فرآورده های غذایی و صحت و سقم آن به یکی از چالش های تولید کنندگان مواد غذایی در بازار کشاورزی و غذایی تبدیل گردیده است (Lenahan, Thomas et al. 1973; Nilsson, Tunçer et al. 2004). این نیاز سبب طراحی مطالعات متعددی در این زمینه شده است تا بتوانند اعتماد مصرف کنندگان به فرآورده های غذایی را به خود جلب کنند. تمامی این موارد با توجه به افزایش روزافزون نیاز مردم جان به فرآورده های غذایی آماده و نیمه آماده، افزایش علم عمومی که سبب شناخت آن ها نسبت به خطرات ناشی از مواد غذایی شده است و در نهایت افزایش توجهات به تأثیری که موجودات اصلاح ژنتیک شده می توانند بر زنجیره غذایی انسان و محیط اطراف گذارند، نشان دهنده اهمیت برنامه کنترل کیفیت و اعتبار سنجی ارائه شده می باشد.
میزان اعتبار برچسب های ارائه شده بر روی مواد غذایی یک مسأله مهم برای مصرف کنندگان و کارشناسان فرآورده های غذایی است زیرا عدم تطابق موارد ارائه شده بر روی برچسب قرار گرفته روی فرآورده های غذایی با منشأ حیوانی می تواند اثرات منفی قابل توجهی را از جنبه های مختلف به دنبال داشته باشد (Angulo, Gil et al. 2005). جنبه های مختلفی ذکر شده را می توان از سه جهت مورد نقد و بررسی قرار داد:
1) تقلب تجاری: با هدف سوء استفاده، تولید کنندگان فرآورده های غذایی می توانند با توجه به قیمت بالای برخی مواد غذایی، آن ها را با موادی که دارای هزینه پایین تری هستند جایگزین نمایند. همچنین می تواند علاوه بر قیمت سبب جایگزینی گونه ای با ارزش غذایی کمتر به جای گونه ای با ارزش غذایی بیشتر شود.
2) ممکن است افرادی به برخی از رژیم های غذایی آلرژی داشته باشند و استفاده از آن ها پیامدهای جبران ناپذیری را به همراه داشته باشد. ذکر موارد اشتباه بر روی فرآورده های غذایی می تواند به سلامت مصرف کننده آسیب برساند.
3) دیگر نکته مهم در بحث فرآورده های غذایی ممنوعیت استفاده از برخی گوشت ها در برخی از مذاهب می باشد. استفاده از این گوشت ها و عدم بیان آن ها در برچسب ارائه شده بر روی آن می تواند اثرات روحی روانی نامناسبی بر روی شخص مصرف کننده گذارد.
مطابق با استانداردهای Appendix، ترکیبات موجود در فرآورده غذایی باید بصورت زیر بر روی برچسب های قرار گرفته بر روی بسته بندی فرآورده درج گردند:
• تمام مواد اولیه مطابق استانداردهای FDA باشند و نام تمام مواد اولیه مورد استفاده در فرآورده به طور مشخص بر روی برچسب بسته بندی درج شود.
• ماده حاصل از هیدرولیز پروتئین باید با نام های مورد استفاده و رایج معرفی گردد و نام پروتئین هیدرولیز شده بر روی برچسب ذکر شود.
• افزودنی های رنگی مجاز FDA نیازمند لیستی از نام های رایج می باشند و افزودنی های رنگی فاقد نام مجاز باید با نام “رنگ مصنوعی ” و یا “رنگ افزوده ” مشخص گردد.
• محصولات گوشتی فرآوری شده مورد استفاده به عنوان ماده اولیه، بدون نیاز به ذکر میزان استفاده آن ها، نیازمند آشکارسازی کامل تمام مواد اولیه در فرمولاسیون فرآورده های گوشت و ماکیان است.
• در فرآورده های حاوی مخلوط گوشت و مرغ، اگر یکی (از نظر کمّی) بسیار بیشتر از دیگری بود باید بر روی برچسب، نام آن ذکر شود و در صورت تساوی مقادیر، نام هر دو ذکر گردد.
• در فرآورده های حاوی پروتئین گیاهی، گوشت تازه و مرغ، اگر میزان گوشت تازه یا مرغ از پروتئین گیاهی بسیاربیشتر بود (مثلاً نسبت 13:1) میزان پروتئین گیاهی فریبنده نیست و فقط نیاز است که بر روی برچسب مواد اولیه ذکر شود اما در صورتی که این نسبت کمتر از 13:1 اما بیشتر و یا مساوی 10:1 باشد، باید نام پروتئین گیاهی در کنار نام محصول ذکر شود مثلاً : هات داگ با گوشت گاو و پروتئین گیاهی بافت دارافزوده شده (Boylston, Chen et al. 2012).
1-5-تکنیک های مرتبط با کنترل کیفی عام
1-5-1-آزمایشات شیمیایی
در این آزمایشات آن ویژگی از ماده اولیه که در تهیه محصول اثر میگذارد فقط مورد آزمایش قرار می گیرد، برای مثال در آرد سوخاری میزان کربوهیدرات را اندازهگیری میکنند. روزانه به صورت تصادفی یک تا دو نمونه از قسمتهای مختلف سالن تولید برداشته و آزمایشات شیمیایی مورد نظر (مثل درصد چربی، روغن، خاکستر و …) را انجام میدهند (Love and Pearson 1971).
1-5-1-1-جستجوی پلیفسفاتها در گوشت و فرآوردههای آن
جهت بررسی و اندازه گیری پلی فسفات ها در گوشت و فرآورده های غذایی از مراحل زیر استفاده می شود (Klose, Campbell et al. 1963):
• تهیه لایه سلولزی
• تهیه نمونه مورد آزمایش
• تهیه سرم
• جداسازی کروماتوگرافی
• تعیین فسفاتها
1-5-2-آزمایشات میکروبی
دستگاههای آزمایشگاه میکروبی، آون، 3 تا انکوباتور با دماهای مختلف، هود باکتریولوژیکی، اتوکلاو، روش های سریع (rapid) (یکسری محیط کشتهایی است که تا 24 ساعت جواب میدهد و با تغییر رنگ بستگی به نوع تغییر رنگ مشخص میکند که سالمونلا، اشیرشیا و … وجود دارند.) میباشد (Ellis, Broadhurst et al. 2002).
1-5-3-روش اندازه‏گیری رطوبت گوشت و فرآورده‏های آن
ظرف را که حاوی 4-3 برابر وزن نمونه مورد آزمون شن است همراه با میله بلوری به مدت نیم ساعت در اتوو 2 ± 103 درجه خشک کنید و بگذارید که ظرف و محتویات آن در دسیکاتور تا درجه حرارت آزمایشگاه سرد شود و سپس با دقت یک میلیگرم آن را توزین کنید. 10-5 گرم از نمونه آماده شده را به ظرف منتقل کرده و مجددا به دقت یک میلیگرم آن را توزین کنید.
برحسب وزن نمونه 10-5 میلیلیتر الکل اتیلیک به ظرف اضافه کرده به وسیله میله طوری مخلوط کنید و آن را روی حمام آب که درجه حرارت آن برای جلوگیری از بیرون انداختن قسمت‏هایی از نمونه بین 80-60 درجه تنظیم شده حرارت دهید و گاهی بهم زنید تا الکل تبخیر شود. ظرف و محتویات آن را مدت 2 ساعت در اتوو که در 2 ± 103 درجه تنظیم شده حرارت دهید، سپس ظرف را از اتوو به دسیکاتور منتقل نمایید و آنگاه بگذارید ظرف تا درجه حرارت آزمایشگاه سرد شود و سپس به دقت یک میلی‏گرم آن را توزین کنید. عملیات بالا را تکرار کنید تا نتیجه دو توزین پشت سرهم که با یک ساعت حرارت دادن از هم فاصله داشته باشند بیش از 1/0% وزن نمونه اختلاف نداشته باشد.
1-5-4-تعیین pH گوشت و فرآوردههای آن
الکترود را داخل نمونه قرار می دهند و سیستم تصحیح دمای pH متر را با دمای نمونه تنظیم می نمایند. نمونه را با همزن بهم زده تا همگن شود و سپس با استفاده از pH متر، pH را اندازه شود. همچنین برای اندازه گیری PH در فرآورده های غیرهمگن، با یک کارد سوراخی در نمونه ایجاد نموده تا در موقع قرار گرفتن الکترود در آن موجب شکستگی نگردد. دمای نمونه را تنظیم نموده و سپس pH را با استفاده از pH متر اندازهگیری نمایید.
1-5-5-اندازه‏گیری پروتئین تام در گوشت و فرآورده‏های آن
در حدود 2 گرم از نمونه آماده شده را در کاغذ صافی کوچک و یا یک ورقه کوچک آلومینیومی که قبلاً توزین شده به دقت 1/0 میلی‏گرم توزین کرده و در داخل بالن هضم بیاندازید. سپس 20 میلی‏لیتر اسید سولفوریک غلیظ و 8 گرم از مخلوط کاتالیزور (96 درصد سولفات پتاسیم و 5/3 درصد سولفات مس و 5/0 درصد اکسید سلینوم) به آن افزوده و بالن را به دستگاه مخصوص هضم کلدال وصل کرده و حرارت دهید. حرارت باید در ابتدا ملایم بوده و پس از این‏که محتوی بالن دیگر کف نکرد حرارت را زیاد کنید و ‏گاهی بالن را به هم بزنید. حرارت را آن‏قدر ادامه دهید تا مواد آلی هضم شود و مایع تقریبا بی‏رنگی در ته بالن باقی بماند سپس حرارت را مدت 5/0 تا 1 ساعت ادامه دهید. هرگاه دیواره بالن آلوده به نمونه باشد بایستی پس از سردشدن بالن هضم آن را با مقدار کم آب مقطر شسته تا تمام نمونه در ته بالن جمع شود سپس مجددا آن را حرارت داده تا مواد آلی کاملا هضم شود. بالن را بگذارید سرد شود و سپس آن را با 400 میلی‏لیتر آب مقطر در دفعات مکرر شستشو داده و از راه قیف مربوط به بالن تقطیر به داخل آن بریزید. عمل شستشوی بالن هضم را چندین مرتبه تکرار کنید تا مطمئن شوید تمام قسمت هضم شده به بالن دستگاه تقطیر وارد شده و چیزی از آن هدر نرفته باشد سپس چند قطعه سنگ جوش به آن بیفزایید. در زیر مبرد دستگاه تقطیر یک ارلنمایر محتوی 500 میلی‏لیتری محتوی 50 میلی‏لیتر محلول اسیدبوریک و چند قطره متیل قرمز قرار دهید. دستگاه تقطیر را با دقت نصب کنید و توجه داشته باشید که شیر آب مربوط به مبرد باز باشد و قسمت‏های مختلف دستگاه به طور محکم به هم مربوط باشند. سپس از راه قیف به مقدار کافی محلول سود 50% بیفزایید تا محیط قلیایی شود (حداقل 75 میلی‏لیتر سود لازم است) بالن را حرارت دهید و عمل تقطیر را در حالی‏که انتهای مبرد در محلول اسید بوریک قرار دارد ادامه داده تا تمام آمونیاک موجود در ظرف گیرنده جمع شود.
در حدود 200 تا میلی‏لیتر از محلول تقطیر شده را جمع‏آوری نموده ابتدا شیر قیف را باز کرده و سپس حرارت را قطع کنید و انتهای مبرد را از داخل محلول اسید بوریک خارج کرده و پس از چند دقیقه تقطیر آزاد حرارت را قطع کنید و قسمت خارجی مبرد را با کمی آب مقطر به داخل ارلنمایر بشویید و محلول را به وسیله اسید سولفوریک 1/0 نرمال تیتر کنید. همین آزمایش را برای محلول شاهد انجام دهید.
1-6-تکنیک های کاربردی در شناسایی گونه های گوشتی

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

علاوه بر تکنیک های کلی ذکر شده جهت کنترل کیفی عام فرآورده های غذایی، تکنیک های متعددی وجود دارند که می توان از آن ها برای شناسایی گونه های استفاده شده در تهیه فرآورده های گوشتی استفاده نمود. مهمترین تکنیک هایی که در حال حاضر برای شناسایی گونه های گوشتی می توان از آنها استفاده نمود در شکل 1-1 و مهمترین تکنیک های کاربردی برای شناسایی پروتئین گیاهی سویا در شکل1-2 خلاصه شده است.
شکل 1-1-تکنیک های موجود برای شناسایی گونه های گوشتی
شکل 1-2-تکنیک های موجود برای شناسایی پروتئین گیاهی سویا
1-6-1- تکنیک های مبتنی بر پروتئین
مرحله اولیه برای بررسی پروتئین ها جداسازی پروتئین ها از نمونه ها است. از مهمترین و معتبرترین روش های جداسازی پروتئین ها می توان به الکتروفورز و کروماتوگرافی اشاره نمود. الکتروفورز اولین بار توسط شیمیدان سوئدی آرن تیسلیوس ابداع شد. در سال 1937، تیسلیوس روشی برای جداسازی الکتروفورتیک پروتئین های سرم ابداع کرد. انگیزه اصلی برای طراحی این روش، که بعدها به الکتروفورز منطقه ای مشهور شد، مشکلاتی بود که در حین بررسی پروتئین های سرم وجود داشت. تیسلیوس برای اولین بار فراکنش های آلفا، بتا، و گاما را در سرم تشریح و نام گذاری کرد. وی به خاطر تحقیق بر روی الکتروفورز و آنالیز جذبی، بخصوص اکتشافاتی که ماهیت پیچیده پروتئین های سرم را مشخص می کرد، جایزه نوبل شیمی را در سال 1948 از آن خود کرد (Altria 1999). از دیگر روش های قدیمی کروماتوگرافی است که خود دارای انواع مختلفی است که اولین نوع آن را می توان کروماتوگرافی ژلی در نظر گرفت. این نوع کروماتوگرافی برای اولین بار در سال 1954 معرفی و در سال 1959 اصلاح شد. در این روش، جداسازی‌هایی مبتنی بر الک کردن مولکولی بر روی اجسام بی‌بار در جریان مهاجرت الکترو اسمزی از داخل ژل‌ها انجام می‌شود. بدین ترتیب که جداسازی بر مبنای اندازه‌های نسبی مولکول ها انجام شده و از اصطلاح صاف کردن به وسیله ژل استفاده می‌شود. ژل استفاده شده در این روش باید بی اثر و پایدار باشد. در ادامه پس از دهه 80 میلادی با توجه به نیاز به ابداع روش های جدید تجزیه تحلیل پروتئین ها با دقت بسیار بالا بر اساس ساختار و عملکرد پروتئین و واکنش بین پروتئین ها جهت جداسازی، ‏شناسایی و تشخیص پروتئین های روش های فوق الذکر ارتقاء پیدا کردند که شامل تکنیک های کاربردی نظیر جدایی پروتئین محلول در آب به وسیله نشاسته، ‏پلی آکریل آمید یا الکتروفورز ژل آگارز‎ ‎، الکتروفورز دو بعدی، کروماتوگرافی مایع و کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا بود (Abramson, Moyer et al. 1942; Lopez 2007).
به طور کلی، در اغلب روش ‏های الکتروفروتیک مربوط به شناسایی گونه ها در گوشت خام، از پروتئین های سارکوپلاسمی استفاده می شود که این موضوع به ‏دلیل دمای بالاتر دناتوراسیون و حلالیت بیشتر پروتئین های سارکوپلاسمی نسبت به سایر پروتئین ها می باشد. از جمله روش های دیگر مبتنی بر پروتئین ها که هیچ ارتباطی به استخراج پروتئین ها ندارد، استفاده از مطالعات بافت شناسی می باشد که در آن پس از تهیه لام های بافتی، توسط آنتی بادی های منوکلونال اختصاصی یک پروتئین خاص هدف گیری شده و توسط میکروسکوپ فلورسانس مورد مطالعه و بررسی قرار می گیرد. این روش نیز کاربرد فراوانی در شناسایی منشأ بافتی و گونه ای نمونه های گوشتی دارد (Stamoulis, Stamatis et al. 2010; Soares, Amaral et al. 2013).
1-6-2- تکنیک های مبتنی برDNA ‏‎ ‎
با توجه به زمانبر بودن و مشکلاتی که در روش های تشخیصی مبتنی بر پروتئین وجود دارد، روش مبتنی بر DNA بر پایه PCR به علت سادگی، اختصاصیت و ویژه بودن و حساسیت این روش برای بررسی کیفیت و سلامت غذایی و تخمین ترکیبات غذایی مناسب تر است و می تواند جانشین مناسب تری برای روش های ایمنی شناسی موجود برای شناسایی گونه های گوشتی شود. مزیت دیگر PCR بر علاوه توانایی تمایز بین گونه های بسیار نزدیک در غذاهای ترکیبی و پیچیده مثل محصولات گوشتی ماریناد شده و حرارت دهی شده ، حتی می تواند برای تمایز منشأ بافتی درون گونه ای نیز استفاده شود (Meyer, Chardonnens et al. 1996).
تکنیک PCR با توجه به حساسیت ویژه و توانایی کابرد حتی در مقادیر بسیار اندک در محصولات خام و فرآوری شده و سرعت باعث می شود که روش های تکثیر DNA در بازبینی و بررسی موادغذایی، شناسایی مواد غذایی اصلاح ژنتیک شده و شناسایی تقلبات در فرآورده های غذایی کاربرد فراوانی داشته باشند (Mafra, Silva et al. 2008).
1-6-2-1-واکنش زنجیره پلیمراز (PCR)
1-6-2-1-الف-اطلاعات اولیه
این روش فوق العاده ساده بوده و با استفاده از تغییرات حرارت می‌توان چندین فرآیند را به دنبال همدیگر انجام داد. با این تکنیک می‌توان به عنوان یک روش قدرتمند تشخیص بالینی (Diagnostic) برای وجود موتاسیون‌ها در ژنوم انسانی، یا برای وارد کردن جهش‌های ویژه به داخل ژن همسانه شده، استفاده کرد. PCR بطور دستی و با قرار دادن پر زحمت و انتقال لوله‌های آزمایش بین حمام‌های آب دارای دمای لازم، بوجود آمد. امروزه دستگاه هایی بطور تجارتی تهیه می‌شوند که در آن ها جایگاه های لوله‌ای با بلوک فلزی حرارت پذیر تعبیه شده است و قابل برنامه ریزی برای تغییر سریع بین دماهای لازم است (Eckert and Kunkel 1991).
1-6-2-1-ب-تاریخچه
در گذشته معمولا از روش های شیمیایی برای تولید قطعات نوکلئوتیدی استفاده می‌کردند، اما این روش ها پر زحمت بوده و نیاز به مدت زمان طولانی داشتند از سال 1980 به بعد عمدتا از روش PCR در آزمایشگاه های زیست شناسی مولکولی استفاده می‌شود (Arnheim and Erlich 1992).
1-6-2-1-ج-مراحل PCR
مرحله دناتوراسیون:
DNA در مرحله اول برای مدت کوتاهی (30 ثانیه) قطعات DNAرا در درجه حرارت 94 درجه سانتی گراد حرارت می‌دهند تا دو زنجیره DNA از هم باز نشود.
مرحله آغازگر و مرحله اتصال دو قطعه نوکلئوتیدی:

این قطعات معمولاً از 25-18 باز آلی تشکیل می‌شوند و می‌توانند به قطعات مکمل خود که بر روی ژن مورد نظر قرار دارند، اتصال یابند. قطعه‌ای که در آن PCR به تعداد زیاد ساخته می‌شود، در واقع ما بین دو آغازگر قرار دارد. مرحله اتصال آغازگرها کوتاه بوده و حدوداً 30 ثانیه در دمای 65-30 درجه سانتیگراد صورت می‌گیرد.
مرحله پلیمریزاسیون یا مرحله سنتز:
در این مرحله با دخالت آنزیم DNA پلیمر از بر روی رشته DNA الگو. سنتز DNA با استفاده از نوکلئوتید تری فسفات‌هایی که در محلول وجود دارند، صورت می‌گیرد و برای سنتز DNA همیشه یک رشته DNA به صورت الگو و یک قطعه پلی نوکلئوتیدی به عنوان آغازگر مورد نیاز است. مراحل کلی PCR در شکل 1-3 شنان داده شده است.
ادامه PCR بعد از چرخه اول:
بعد از این 3 مرحله ، چرخه اول تمام می‌شود، چرخه‌های بعدی تکرار چرخه اول است. بدین صورت به دنبال چرخه‌های متعدد PCR قطعه DNA مورد نظر بطور تصاعدی افزایش می‌یابد. یعنی از 20 چرخه، ژن مورد نظر دارای بیش از 250 هزار خواهد بود. بنابراین روش PCR روش کارا در ازدیاد یک قطعه از DNA است (Innis, Gelfand et al. 1990).
شکل1-3-مراحل مختلف تکنیک PCR


پاسخ دهید